Rhod-2是一种高亲和力的可见光激发波长Ca2+荧光探针，波长明显长于Fluo-3或Fluo-4，其与Ca2+结合后的大激发波长为550nm，发射波长为578nm，这类探针更适用于具高水平自荧光信号的细胞或组织Ca2+水平检测，也可用来检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放。

      Rhod-2 AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-2，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

基本特性

主要特征

      长波长钙离子探针，能够与GFP和绿色荧光探针兼容；

      特别定位在线粒体。以罗丹明结构为基础的Rhod-2 AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察加载进入细胞呈现点状染色模式。有文献认为，Rhod-2是线粒体Ca2+的选择性探针，不过这一理论并未得到广泛支持。

      检测平台：荧光成像，流式细胞术，酶标仪，高内涵筛选（HCS）

Rhod-2 AM的应用

      Rhod-2，波长明显长于Fluo-3/Fluo-4，Ex/Em=552/581nm（Ca2+结合），更适用于具高水平自荧光信号的细胞或组织Ca2+水平检测，也可用来检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放；

使用说明

（1）工作液配制

      1）储存液配制：产品以粉末形式提供，开盖前需要经过瞬时离心。如果产品是从冰箱中取出则需要先置于室温进行回温。取适量 Rhod-2 AM 用无水 DMSO 充分溶解，配制浓度为 1-5 mM 的储存液。储存液配置的浓度可以根据实验需求进行调整。使用者可根据需要进行分装，储存于-20℃，注意保持干燥，避光，避免反复冻融。【注意】：溶剂 DMSO 一定要保证高质量无水，否则将会导致乙酰氧甲酯（AM）水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

      2）工作液配制：用合适的缓冲液（如 HBSS）直接稀释储存液到需要的工作液浓度，充分混匀。推荐的工作液浓度为 1-10 μM。使用者可根据实验需要进行调整和配制。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在有效范围内尽量使用最低浓度。工作液需现配现用

      3）（可选）如果 Rhod-2 AM 进入细胞的效果不好，在配制工作液时可加入 20% Pluronic F127溶液（终浓度为 0.02% -0.05%），将 Rhod-2 AM 分散在溶液中防止其聚合并能帮助进入细胞。

      【注意】：在配制储存液的时候不要加入 Pluronic F127，因为 Pluronic F127 会降低 Rhod-2 AM的稳定性。

（2）染色步骤

      1）取出培养到合适密度的细胞，除去旧培养液，使用缓冲液洗涤细胞 3 次。细胞黏附在培养板上或制成细胞悬液均可。注意：如果使用含血清的培养液，血清中的酯酶会分解 AM，影响 Rhod-2 AM 进入细胞。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养液残留。

      2）将适量的 Rhod-2 AM 工作液加入细胞中，在 37℃培养 15-60 min，然后除去 Rhod-2 AM工作液。

      3）用缓冲液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的 Rhod-2 AM 工作液。然后加入缓冲液覆盖细胞。

      4）37℃培养箱孵育约 20-30 min，以确保细胞内的 AM 完全去酯化。

      5）荧光显微镜观察染色情况。

      注意，一些细胞尤其是含有有机阴离子转运蛋白的细胞，会发生荧光探针泄漏，此时需加入一些抑制剂防止这种情况的发生，可以将丙磺舒（probenecid，2-5 mM）或亚砜吡嗪（sulfinpyrazone，0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中，以减少去酯化探针的泄漏。抑制剂的加入量需要经过优化，过量会对细胞造成不利影响。

注意事项

      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作