本产品BrdU检测试剂盒，用于细胞和组织切片的细胞增殖检测。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脱氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)类似物，本试剂盒的原理在于，BrdU可以通过竞争替代胸腺嘧啶核苷T掺入DNA合成期(S期)。当处于旺盛分裂的细胞掺入BrdU后，利用抗BrdU抗体和抗体连接酶或荧光素作为指示系统，即可检测出含有BrdU的细胞，结合其它细胞标记物进行双重标记，可判断出增殖细胞的种类、增殖速度等，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU经活体注射或细胞培养时进入组织细胞，掺入DNA定位准确，可有效反应S期细胞新合成DNA的水平，而且受细胞内外环境影响小，标记不会丢失。

储存与运输

      冰袋（wet ice）运输；破膜液、封闭液（3% BSA）、1 M HCl可4℃保存，4%多聚甲醛可常温保存，anti-BrdU (mouse mAb)需-20℃保存，有效期12个月。

实验准备

      1. 自备PBS缓冲液（推荐ABC4220）、二抗、梯度乙醇、封片剂等；

      2. 自备细胞核染色液，推荐ABC1022苏木素染液或ABC1030 DAPI染液（即用型）；

      3. 配制anti-BrdU一抗工作液：将anti-BrdU(mouse mAb)用封闭液（3% BSA）稀释100倍，配制成anti-BrdU一抗工作液，现配现用，4℃保存；

      4. 二抗工作液：根据检测需要自备HRP标记（后续经白光检测，配套DAB显色试剂盒，推荐ABC1230）或荧光标记（后续荧光检测）的抗小鼠二抗，并用PBS稀释配制成二抗工作液。

操作步骤

细胞样品：

      1. 细胞准备：提前准备细胞爬片，确保细胞状态正常，贴壁良好；

      2. BrdU孵育：细胞经含BrdU的培养基于培养箱中避光孵育一定时间，BrdU浓度及细胞孵育时间依据细胞种类不同，建议预实验摸索最佳条件。注意事项中已测试细胞实验条件可供参考；

      3. 细胞固定：上述经BrdU孵育的细胞爬片，PBS洗3次，每次5 min。向孔板内加入1 mL 4%多聚甲醛覆盖细胞，室温固定20-30 min。PBS洗3次，每次5 min；

      4. 通透：向孔板内滴加破膜液覆盖细胞处理8-10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      5. 细胞核染色（可选）：

      若后续白光检测，则用苏木素染细胞核：向孔板内滴加苏木素染液室温染色5 min，吸弃苏木素染液，PBS洗3次，每次5 min；

      若后续荧光检测，则用DAPI染细胞核：向孔板内滴加DAPI染液室温染色5 min，吸弃DAPI染液，PBS洗3次，每次5 min；

      6. 再固定：向孔板内滴加4%多聚甲醛室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      7. 酸化：向孔板内滴加1 M HCl覆盖细胞，37℃处理10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      8. 后固定：再次向孔板内滴加4%多聚甲醛室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      9. 封闭：向孔板内滴加封闭液（3% BSA）室温孵育30 min。吸弃封闭液，不要清洗；

      10. Anti-BrdU抗体孵育：向孔板内滴加anti-BrdU一抗工作液覆盖细胞，4℃孵育过夜。吸弃anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；

      11. 二抗孵育：向孔板内滴加二抗工作液覆盖细胞，室温孵育1 h。吸弃二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用荧光标记的二抗，孵育及洗涤时均需避光；

      12. 封片及镜检：

      若是HRP标记的二抗，则用DAB显色试剂（推荐ABC1230）对细胞样品进行显色，脱水，透明，用尖头镊子轻轻将爬片挑起，倒扣在洁净的载玻片上封片，显微镜观察；

      若是荧光标记的二抗，在洁净载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂（推荐ABC1419），用尖头镊子轻轻将爬片挑起，倒扣在载玻片上封片，荧光显微镜观察；

组织切片样品：

      1. 动物准备：需提前准备实验动物，并进行体内BrdU标记，可参考ABC310020-100mg。体内标记后根据实验需要进行取材、固定及制备石蜡切片；

      2. 组织石蜡切片脱蜡复水；

      3. 修复：组画笔画圈圈住组织，将切片浸没在抗原修复液中，微波加热修复，参考修复条件：额定输入功率：1180W；微波输出功率：700W，使用1×Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0，即用型）（货号ABC1225)， 中火 8min 停火 8min 转中低火 7min。微波修复的目的是让切片在抗原修复液保持沸腾15分钟，由于不同厂家型号的微波炉功率不一样，达到沸腾的时间也不一样，具体的修复条件可以根据微波炉功率的不同进行优化。自然冷却；

      4. 细胞核染色（可选）：

      若后续白光检测，则用苏木素染细胞核：切片入苏木素染液室温染色5 min，PBS洗3次，每次5 min；

      若后续荧光检测，则用DAPI染细胞核：向组织上滴加DAPI染液室温染色5 min，倾去DAPI染液，切片经PBS洗3次，每次5 min；

      5. 再固定：向组织上滴加4%多聚甲醛室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      6. 酸化：向切片上滴加1 M HCl覆盖组织，37℃处理10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      7. 后固定：再次向切片上滴加4%多聚甲醛覆盖组织室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

      8. 内源性过氧化物酶淬灭（可选）：向切片上滴加3% H2O2室温孵育25-30min，去除内源性过氧化物酶。随后切片经PBS洗3次，每次5 min；

      9. 封闭：向切片上滴加封闭液（3% BSA）覆盖组织，室温孵育30 min。去除封闭液，不要清洗；

      10. Anti-BrdU抗体孵育：向切片上滴加anti-BrdU一抗工作液覆盖组织，4℃孵育过夜。去除anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；

      11. 二抗孵育：向切片上滴加二抗工作液覆盖组织，室温孵育1 h。去除二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用荧光标记的二抗，孵育及洗涤时均需避光；

      12. 封片及镜检：

      若是HRP标记的二抗，则用DAB显色试剂（推荐ABC1230）对组织切片进行显色，脱水，透明，封片后显微镜观察；

      若是荧光标记的二抗，则滴加抗荧光淬灭封片剂（推荐ABC1419）封片后荧光显微镜观察。

结果观察

      如果用HRP标记的二抗检测，细胞核呈深蓝色，增殖细胞呈棕色。如果是荧光标记的二抗，细胞核呈蓝色荧光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖细胞为对应二抗的荧光。

注意事项

      1. 对于细胞爬片样品，BrdU的使用浓度和处理时间与细胞种类有关。一般来说，处理肿瘤细胞所需浓度和时间都较低，成纤维细胞或上皮细胞等增殖较慢的细胞需要提高浓度并延长作用时间，建议浓度范围为20-100 μM，作用时间为40 min-4 h，可根据具体细胞的种类进行摸索调整。

      下表为测试的常用细胞处理浓度及时间，仅供参考。

      2. 为保证最佳实验效果，推荐使用本公司生产的其他配套试剂：苏木素染液(ABC1022)；DAPI染液(ABC1030)；DAB显色试剂盒(ABC1230），抗荧光淬灭封片剂(ABC1419)；

      3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。