Calcein AM是在Calcein（钙黄绿素）的基础上，引入了一个乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，AM基团不仅掩盖了Calcein螯合钙的分子部分且增强了其疏水性，因此可以使Calcein AM轻易穿透活细胞膜，被细胞内源性酯酶剪切为Calcein。失去AM基团的Calcein不能轻易通过细胞膜，从而被滞留在细胞内；此外螯合钙的分子部分被暴露出来，使得Calcein探针和活细胞内钙离子结合，并发出较强绿色荧光。而死细胞缺乏酯酶，并不能使Calcein AM被水解成能Calcein，故无法标记死细胞。Calcein AM细胞毒性低，对细胞功能影响较小，如细胞增殖或淋巴细胞的趋化性等，是一款非常适用于活细胞染色的荧光探针。

      本产品Calcein AM细胞活性检测试剂盒也被称为细胞荧光计数试剂盒（Cell Fluorescence Counting Kit，CCK-F），是通过Calcein AM荧光探针标记活细胞，来评判细胞的活性、毒性、增殖的检测试剂盒。本试剂盒经过优化和调试，不仅检测灵敏度高、线性范围宽，且只需要短时间的孵育，便可完成对细胞的检测。操作简单，不需要放射性同位素标记、也不需要结晶溶解等步骤，可减少实验操作带来的误差，提高准确性和可重复性。

储存与运输

      冰袋(wet ice)运输；

      -20℃保存，Calcein AM溶液需避光保存，并尽量避免反复冻融；12个月有效。

操作步骤

      1. Calcein AM检测工作液配制：

      根据96孔板每孔100 μL使用量，参考下表，将Calcein AM溶液和CCK-F检测缓冲液按比例混合，配制成Calcein AM检测工作液。

      2. 贴壁细胞检测：

以下步骤主要对应96孔板检测方案，其他孔板体系需视情况进行调整。

            a. 细胞种板：将细胞按一定密度均匀接种于96孔板中，对其进行药物或者其他前处理（接种密度由细胞的大小、生长速度等因素决定）；

            b. （选做）细胞洗涤：吸取原培养基，用PBS缓冲液（推荐ABC4220）洗涤1-2次，减少血清、酚红或者药物对实验结果的干扰；

            c. 探针标记：去除细胞培养基或PBS缓冲液后，加入100 μL Calcein AM检测工作液，于37℃避光孵育30 min；

            d. （选做）细胞孵育：更换细胞培养基，继续孵育15-30 min，以确保细胞内Calcein AM充分水解；

            e. 荧光检测：使用酶标仪进行荧光读数，Calcein AM探针最大激发光波长为501 nm，最大发射光波长为521 nm。细胞活性与荧光强度成正比。根据不同的实验目的，也可进一步复染细胞核或使用其他仪器（例如荧光显微镜）检测。

      1. 悬浮细胞检测：

            a. 细胞接种：将细胞按一定密度均匀接种于24孔板中，对其进行药物或者其他前处理（接种密度由细胞的大小、生长快慢等因素决定）；

            b. （选做）细胞洗涤：1000 g离心3-5 min去除原培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，每次需要1000 g离心3-5 min，以减少血清、酚红或者药物对实验结果的干扰；

            c. 探针标记：1000 g离心3-5 min后，去除细胞培养基或PBS缓冲液，加入适量Calcein AM检测工作液，于37℃避光孵育30 min；

            d. （选做）细胞孵育：更换细胞培养基，继续孵育15-30 min，以确保细胞内Calcein AM充分水解；

            e. 荧光检测：使用酶标仪或流式细胞仪对其进行荧光检测，Calcein AM探针最大激发光波长为501 nm，最大发射光波长为521 nm。细胞活性与荧光强度成正比。根据不同的实验目的，也可以进一步复染细胞核或用其他仪器（例如荧光显微镜）检测。

注意事项

      1. Calcein AM溶液在使用前进行短时离心，以减少试剂损失。

      2. Calcein AM溶液避免反复冻融，收到产品后建议适当分装，于-20℃避光密封保存。

      3. Calcein AM在水溶液中不稳定，Calcein AM检测工作液需现配现用，24 h内有效。

      4. 由于不同细胞状态不同，Calcein AM检测工作液孵育的时间和浓度可以视情况进行调整。

      5. 使用酶标仪检测荧光强度时，请使用黑色细胞培养板。

      6. 荧光染料存在淬灭问题，请避光操作和存放。

      7. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。