乳酸脱氢酶（LDH）是糖酵解途径的末端酶，广泛存在于动物、植物、微生物中，参与催化丙酮酸和乳酸之间的可逆反应。通常LDH在细胞胞浆内含量丰富，正常细胞由于细胞膜的屏障保护作用，胞内LDH不能随意通过细胞膜。但当细胞受到损伤或者死亡时，细胞膜的屏障保护作用消失，细胞内的LDH被释放至培养液中。通过检测细胞膜破裂释放到培养液中的LDH含量，即可对细胞毒性进行定量分析。

      乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒主要原理是利用LDH将NAD+被还原成NADH，进一步NADH和INT（四唑盐）在Diaphorase（硫辛酰胺脱氢酶）催化下，生成NAD+和红色甲臜，甲臜产生的量和LDH的含量成线性正相关，且能够在490 nm波长下产生吸收峰，因此可以通过仪器进行定量分析。本试剂盒主要用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测，同时也可用于以细胞总LDH为基础的细胞增殖和毒性检测。

储存与运输

      冰袋(wet ice)运输；-20℃保存，INT溶液需避光保存，酶溶液避免反复冻融；12个月有效。

操作步骤

      1. 样品前准备：

            1) LDH释放检测样品准备：

                  a. 细胞接种：将细胞以合适的密度接种于96孔细胞培养板中，可根据实验需求设置多个分组，例如：背景空白对照孔（仅含细胞培养基）、样品对照孔（未经处理的细胞孔）、样品最大酶活性对照孔（未处理孔，细胞裂解后测胞内总LDH量）、处理样品孔（实验组）等；

                  b. 细胞处理：根据实验设计，除去原有培养基，使用PBS缓冲液（推荐ABC4220）洗涤一次，根据分组换上对应的含药物或者不含药物的无血清或低血清培养基，并孵育一定时间；

                  c. 样本收集：将细胞培养板1000 g离心5 min，取80 μL培养上清液，加到新的96孔板中，随后对样品进行测定（样品最大酶活性对照孔的样品准备工作，请参考细胞内总LDH检测样品准备步骤）。

            2) 细胞内总LDH检测样品准备：

                  a. 细胞接种：将细胞以合适的密度接种于96孔细胞培养板中，可根据实验需求设置多个分组；

                  b. 细胞处理：根据实验设计，使用含药物或者不含药物的培养基（可含血清）孵育细胞；

                  c. 细胞裂解：达到预定时间后，去除原培养基，用PBS洗涤一遍，加入120 μL细胞裂解工作液（10×细胞裂解液使用PBS稀释10倍），并于培养箱中孵育30-60 min；

                  d. 样本收集：将细胞培养板1000 g离心5 min，取80 μL裂解上清液加到新的96孔板中，随后进行测定。

            3) （选做）LDH标准样品准备：

                  如需对LDH酶活性的进行绝对定量，请自行购买和配制不同浓度LDH标准品，浓度可设置为10 mU/mL、5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。以每孔80 μL，梯度加至96孔板中。

      2. LDH检测：

            1) 根据待测样品数量，参考下表配制适量的LDH检测工作液（主要对应96孔板检测，其他规格的孔板，可视情况进行调整）；

            2) 将LDH检测工作液，加入到待检测样品孔中，每孔80 μL（样本与LDH检测工作液体积比为1:1），轻敲混均；

            3) 将其放入细胞培养箱中，避光孵育30 min，也可用锡箔纸包裹，室温于水平摇床上孵育30 min；

            4) 使用酶标仪，在490 nm处测定吸光度。可使用600 nm或大于600 nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。

      3. LDH结果计算：

            1) 常规LDH（释放）细胞毒性检测：

                  a. 将样品对照孔、样品最大酶活性对照孔、处理样品孔等OD490减去背景空白对照孔OD490，并用于后续的计算；

                  b. 细胞毒性或死亡率计算（%）=（处理样品孔OD490－样品对照孔OD490）/（样品最大酶活性对照孔OD490－样品对照孔OD490）×100%

            2) LDH酶活性的相对定量（根据计算结果可以比较不同样品处理组间有无统计学差异等）：

                  a. 测定一个已知浓度的LDH标准品OD490；

                  b. 待测样品LDH活性（mU/mL）=（样品孔OD490－背景空白对照孔OD490）/（标准品OD490－背景空白对照孔OD490）×标准品浓度（mU/mL）

            3) LDH酶活性的绝对定量:

                  a. 测定一系列LDH梯度标准品OD490，根据所得的吸光值绘制标准曲线，并计算出趋势公式：Y（OD490）=A×LDH活力单位（mU）+B，可通过Excel等软件计算出趋势线的斜率和截距；

                  b. 检测体系中LDH活性（mU）=（样品孔OD490－背景空白对照孔OD490－B）/A

                  c. 样品LDH活性（mU/mL）=检测体系中LDH活性（mU）/检测体积（mL）

注意事项

      1. 细胞检测时，密度不要超过85%，细胞的状态和密度等因素都会对细胞LDH释放造成一定的影响，且样品准备好后，尽量当天完成检测，不要冷冻；

      2. 血清中含有乳酸脱氢酶，建议使用无血清或者低血清培养基；如必须使用10%血清，需设置无细胞对照组，以消除背景干扰；

      3. 操作时尽量温和，避免产生气泡，以免对实验结果产生影响；

      4. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。