本试剂盒适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的RNA提取，利用超顺性磁珠可逆的结合核酸的特性，再搭配精心优化的裂解缓冲液体系，可快速、有效地分离出细菌中的RNA，提取过程可在30-40 min内完成，得到的RNA完整性好、纯度高、产量大，适用于RT-PCR、Real-Time PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游分子生物学实验。

储存与运输

      Lysozyme（50 mg/mL）、DTT solution和DNase冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其它试剂室温运输，室温储存，有效期12个月。

使用前准备

1. 请自备10 mM Tris-HCl（pH 8.0），用于重悬收集的细菌菌体和稀释溶菌酶。

2. 若提取革兰氏阳性菌RNA，请提前准备37℃的水浴或加热块。

3. 若Buffer GRL出现沉淀，请于37℃加热溶解，待恢复至室温后使用。

4. 请在使用前向Buffer GRL加入DTT Solution至4%，即每1 mL Buffer GRL加40 μL DTT Solution，最好现用现配，加入DTT Solution的Buffer GRL可于4℃保存1周。

5. DNase工作液现用现配。

6. 使用前请向Buffer RW1中加入18 mL无水乙醇，混合均匀后使用。

7. 使用前请向Buffer RW2中加入64 mL无水乙醇，混合均匀后使用。

操作步骤

1. 取1-3 mL菌液（细菌总量不超过1×10⁹），12,000 rpm（~13,400×g）4℃离心2 min收集菌体；

      注：上清请务必去除干净，否则会影响细菌细胞壁的消化。

      注：菌体不宜过量，否则会造成产量降低、基因组残留以及蛋白污染等问题，当OD600=1时建议取1 mL的菌液量。

2. 将菌体重悬于100 μL含溶菌酶的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中，溶菌酶浓度及孵育条件见下表：

3. 向孵育后的细菌悬液中加入200 μL Buffer GRL（使用前请确认已加入DTT solution），涡旋振荡混匀；

4. 向离心管中加入300 μL无水乙醇，使用移液器吹打混匀（可能会出现沉淀）；

5. 向混合液中加入20 μL SweMag Beads（SweMag Beads使用前需涡旋至分散均匀），使用移液器吹打至磁珠分散均匀，室温静置5 min，期间使用移液器吹打混匀2-3次，使磁珠保持分散均匀的状态；

6. 将离心管移至磁力架上静置30 s，使磁珠吸附至管壁，待上清清澈后，吸弃上清（为避免影响提取效率，勿将磁珠吸出），将离心管从磁力架上取下；

7. 向离心管中加入500 μL Buffer RW1，使用移液器吹打至磁珠分散均匀，再将离心管移至磁力架上静置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸弃上清（为避免影响提取效率，勿将磁珠吸出），将离心管从磁力架上取下；

8. 向离心管中加入600 μL Buffer RW2，用移液器吹打至磁珠分散均匀，再将离心管移至磁力架上静置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸弃上清（为避免影响提取效率，勿将磁珠吸出），将离心管从磁力架上取下；

9. 配制DNase工作液：取85 μL Nuclease-free Water、10 μL 10×DNase Buffer和5 μL DNase置于一新的Nuclease-free离心管中，使用移液器轻轻吹打混匀；

10. 将DNase工作液沿管壁加入到离心管中，将管壁的磁珠冲刷下来并使用移液器轻轻吹打混匀，室温放置15 min，期间使用移液器多次吹打混匀；

11. 向离心管中加入600 μL Buffer RW2，用移液器吹打至磁珠分散均匀，再将离心管移至磁力架上静置30 s，使磁珠吸附到管壁，待上清清澈后，吸弃上清（为避免影响提取效率，勿将磁珠吸出）；

12. 重复操作步骤11；

13. 将离心管盖打开，置于超净工作台中放置5–10 min，使乙醇完全挥发（请勿使磁珠过度干燥，以免磁珠结块影响核酸得率）；

14. 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入50-100 μL Nuclease-free Water，用移液器轻轻吹打至磁珠分散均匀，室温静置3-5 min，期间使用移液器吹打混匀2-3次；

15. 将离心管置于磁力架上，直至磁珠完全吸附，吸取上清至一新的离心管中，即得高纯度的RNA；

16. 得到的RNA溶液请于-80℃保存。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。

2. 实验时应穿实验服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免讲话，提取RNA过程中所使用的器具和配制溶液所用的水或试剂请确保为Nuclease-free的制品。

3. 不同细菌细胞壁的酶解难易程度不同，革兰氏阳性菌细胞壁一般较难酶解，客户可根据细菌种类调整溶菌酶浓度和孵育时间。

4. 部分试剂易挥发和氧化，应避免试剂长时间暴露于空气中，各试剂使用后应及时盖紧盖子。

5. 应使用RNA提取专用操作实验台与电泳设备。