活性氧(ROS)检测试剂盒，也称Reactive Oxygen Species Assay Kit或ROS Assay Kit，是一种基于荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA，中文全称2',7'-二氯荧光素二乙酸酯，分子量487.29，DCFH-DA本身不具有荧光性，可以自由穿过细胞膜。进入细胞后可以被细胞内广泛存在的酯酶水解生成DCFH。DCFH不具有细胞膜通透性，从而被阻滞在细胞内。无荧光性的DCFH可被细胞内的活性氧ROS氧化生成有荧光的DCF，产生的荧光信号强度与细胞内ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号，因此可以间接评判细胞内活性氧水平。

      本产品活性氧(ROS)检测试剂盒即基于此原理基础快速有效的对细胞内活性氧进行检测灵敏度高，使用方便。同时提供ROS阳性诱导试剂，能够在较短时间诱导多类细胞内ROS水平，以提供阳性样本。以6孔板每孔加样量为标准计算，本试剂盒可测定约100次。

储存与运输

      冰袋运输；-20℃避光保存，12个月有效。

操作步骤

      1. 实验前准备：

            1.1. DCFH-DA工作液配制：将DCFH-DA探针以1:1000比例，用不含血清的细胞培养基或Earle’s平衡盐溶液（ABC4231）稀释，配制成DCFH-DA工作液；

            1.2. （可选）活性氧阳性诱导剂工作液配制：将活性氧阳性诱导剂（2×）与不含血清的细胞培养基或Earle’s平衡盐溶液（ABC4231）1:1体积混合稀释，配制成1×活性氧阳性诱导剂工作液；

      2. （可选）阳性对照组细胞准备：

            2.1. 取状态良好的贴壁去除原培养基，悬浮细胞通过离心去除培养基；

            2.2. 加入1×活性氧阳性诱导剂工作液覆盖贴壁细胞或重悬悬浮细胞，置于37℃ CO₂培养箱中避光孵育45 min（不同细胞敏感性不同，如果在刺激45 min后观察不到活性氧的升高，可适当延长诱导时间或提高诱导剂浓度，如果活性氧升高得过快，可适当减少诱导时间或降低诱导剂浓度）；

      3. 贴壁细胞活性氧检测：

            3.1. 细胞种板：至少提前1日将状态良好的细胞按一定密度均匀接种于孔板中，并根据实验需要对其进行药物或者其他前处理（接种密度由细胞的大小、生长速度等因素决定，保证检测时细胞汇合度在50-70%）；

            3.2. 细胞洗涤：吸除细胞培养基，用PBS缓冲液（ABC4220）洗涤1-2次，减少血清、药物等物质对实验结果的干扰：

            3.3. 装载探针：吸除洗涤缓冲液，参考下表加入对应体积的DCFH-DA工作液，置于37℃ CO₂培养箱中避光孵育30 min。然后吸除DCFH-DA工作液，用PBS缓冲液洗涤2-3次，以充分去除多余的探针；最后用PBS覆盖细胞。

            吸除DCFH-DA工作液，用PBS缓冲液洗涤2-3次，以充分去除多余的探针；最后用PBS覆盖细胞。

            3.4. ROS检测：孔板内标记好的细胞直接置于荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。或消化后收集细胞用荧光分光光度计、酶标仪、流式细胞仪等仪器的检测。使用488nm激发波长，525nm发射波长，DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

      4. 悬浮细胞活性氧检测（也适用于前处理后消化重悬的贴壁细胞）：

            4.1. 细胞前处理：根据实验需求，选取状态良好的细胞，根据实验需要对其进行药物或者其他前处理后，1000 rpm离心3-5 min收集细胞（细胞密度需根据后续检测体系、方法以及总量决定，如：流式检测单份细胞数量不少于10⁴）；

            4.2. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤1-2次，1000 rpm离心3-5 min去除上清收集细胞；

            4.3. 装载探针：加入一定体积的DCFH-DA工作液，使细胞密度为1X10⁵ -5X10⁵个/mL，置于37℃ CO²培养箱中避光孵育30 min。期间每5 min轻轻晃动混匀，以确保探针和细胞充分接触。孵育结束后，1000 rpm离心3-5 min，去除DCFH-DA工作液，并用PBS缓冲液洗涤2-3次，以充分去除多余的探针。最后用PBS重悬细胞。

            4.4. ROS检测：探针标记过的细胞可直接用荧光分光光度计、酶标仪、流式细胞仪等检测。也可以滴到载玻片上，用荧光显微镜或共聚焦显微镜等仪器观察。使用488nm激发波长，525nm发射波长，DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

注意事项

      1. 实验过程中如果探针标记后整体荧光强度过高或过低，可以适当调整DCFH-DA探针的稀释倍数以及孵育时间。

      2. 未进入细胞的探针，会导致较高的背景，请尽量洗净。

      3. 活性氧阳性诱导剂，主要是用于阳性对照组样品的诱导，根据实验需要选择是否做阳性对照。

      4. 细胞每次离心对总细胞密度会有一定损耗，请注意控制初始细胞量，以防最后细胞量不够检测的现象。

      5. 由于荧光探针存在猝灭的情况，请尽量缩短探针孵育后到检测所用的时间（刺激时间除外）。

      6. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。