本试剂盒适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的RNA提取，采用独特的裂解缓冲系统，结合硅胶柱纯化技术可快速有效地提取细菌的RNA，提取过程可在30-40 min内完成，RNA得率大，纯度高，适用于RT-PCR、Real-Time PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游分子生物学实验。

储存与运输

      Lysozyme（50 mg/mL）、DTT solution和DNase冰袋（wet ice）运输，-20℃保存；其它试剂室温运输，室温储存，有效期12个月。

使用前准备

1. 请自备10 mM Tris-HCl（pH 8.0），用于重悬收集的细菌菌体。

2. 若提取革兰氏阳性菌RNA，请提前准备37℃的水浴或加热块。

3. 若Buffer BRL出现沉淀，请于37℃加热溶解，待恢复至室温后使用。

4. 请在使用前向Buffer BRL加入DTT Solution至4%，即每1 mL Buffer BRL加40 μL DTT Solution，最好现用现配，加入DTT Solution的Buffer BRL可于4℃保存1周。

5. DNase工作液现配现用。

6. 使用前请向Buffer RW2中加入64 mL的无水乙醇，混合均匀后使用。

操作步骤

1. 取1-3 mL菌液（细菌总量不超过109），12,000 rpm（~13,400×g）4℃离心2 min收集菌体；

      注：上清请务必去除干净，否则可能影响细菌细胞壁的酶解消化过程。

      注：菌体不宜过量，否则可能会造成产量降低、基因组残留以及蛋白污染等问题，OD600=1时建议取1 mL的菌液量。

2. 将菌体重悬于100 μL含溶菌酶的10 mM Tris-HCl中，溶菌酶浓度及孵育条件见下表：

3. 向孵育后的悬液中加入350 μL Buffer BRL（使用前请确认已加入DTT solution），涡旋振荡混匀；

4. 加入250 μL无水乙醇，使用移液器吹打混匀（可能会出现沉淀），将混合液和沉淀全部转入RNA Spin Column中，12,000 rpm（~13,400×g）室温离心1 min，弃滤液；

5. 向RNA Spin Column中加入350 μL Buffer RW1，12,000 rpm（~13,400×g）室温离心1 min，弃滤液；

6. 配制DNase工作液：取40 μL Nuclease-free Water、5 μL 10×DNase Reaction Buffer和5 μL DNase置于一新的Nuclease-free离心管中，使用移液器轻轻吹打混匀；

7. 将DNase工作液悬空滴加到RNA Spin Column的膜中央，室温静置15 min；

8. 向RNA Spin Column中加入350 μL Buffer RW1，12,000 rpm（~13,400×g）室温离心1 min，弃滤液；

9. 向RNA Spin Column中加入600 μL Buffer RW2（请沿管壁加入Buffer RW2，有助于冲洗管壁上残留的盐分），12,000 rpm（~13,400×g）室温离心1 min，弃滤液；

10. 重复步骤9；

11. 将RNA Spin Column重新置于收集管上，12,000 rpm（~13,400×g）室温离心2 min，取出RNA Spin Column置于新的Nuclease-free的1.5 mL离心管上；

12. 将RNA Spin Column开盖室温放置3-5 min，尽量使残留的乙醇挥发完全；

13. 向RNA Spin Column的膜中央悬空加入50-100 μL Nuclease-free Water，室温静置2 min，12,000 rpm（~13,400×g）室温离心2 min，收集RNA溶液。若要得到更高浓度的RNA，也可以将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column中，室温静置2min，12,000 rpm（~13,400×g）室温离心2 min，再次洗脱RNA；

14. 得到的RNA溶液请于-80℃保存。

注意事项

1. 操作之前，请务必认真阅读本产品说明书。

2. 实验时应穿实验服，戴一次性手套，佩戴口罩，避免讲话，提取RNA过程中所使用的器具和配制溶液所用的水或试剂请确保为Nuclease-free的制品。

3. 提取完成的RNA在继续处理过程中应使用Nuclease-free的玻璃或塑料器皿。玻璃器皿可在150℃烘箱内烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH溶液中浸泡10 min，然后用水清洗干净，再121℃灭菌30 min，即可去除RNase。

4. 不同细菌细胞壁的酶解难易程度不同，革兰氏阳性菌细胞壁一般较难酶解，客户可根据细菌种类适当摸索溶菌酶浓度和孵育时间。

5. 部分试剂易挥发或氧化，应避免试剂长时间暴露于空气中，各试剂使用后应及时盖紧盖子。

6. 应使用RNA提取专用操作实验台与电泳设备。