本产品TSAPLus荧光三重染色试剂盒，适用于石蜡切片免疫荧光多重染色，尤其适用于相同来源一抗的多重荧光免疫标记，也可用于不同来源抗体的多重荧光免疫标记。主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称TSA技术。TSA技术主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在HRP催化H2O2下形成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。本试剂盒使用荧光染料488/555/647对酪胺进行标记，得到的荧光酪胺荧光强，信号稳定，应用于多次重复免疫标记实现多重荧光染色。

试剂盒内各组分按各自所需条件保存，冰袋（wet ice）运输。12个月有效。

1.自备0.01 mol/L PBS缓冲液（pH7.0-7.4，推荐ABC4220或ABC0020），3% H2O2和0.3% H2O2；

2.自备一抗及相应HRP标记二抗，抗原修复液（根据抗体及组织类型选择合适的抗原修复液）；

3.根据用量，按照下表比例配制TSA染色工作液。

注：荧光Tyramide融化后离心机短时离心，干净吸头吹吸混匀后取用。TSA染色工作液建议现配现用，需4℃避光保存，24h内有效。

以组织切片为例，以下实验步骤中的实验用水均为纯水：

1.组织切片脱蜡至水；

2.抗原修复：根据所使用的一抗及样本类型，采用合适方式对组织切片进行抗原修复。PBS清洗3次，每次5min；

3.用免疫组化笔对组织画圈标记；

4.灭活内源性过氧化物酶：向切片上滴加3%H2O2覆盖组织，室温避光孵育25min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色。PBS清洗3次，每次5min；

5.封闭：切片水分稍微甩干后，向组织上滴加3%BSA或血清封闭30 min，具体根据一抗及二抗种属决定封闭试剂；

6.一抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将一抗稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的一抗覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5min；

7.对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5min；

8.向组织上滴加50-100μL TSA-488染色工作液确保完全覆盖组织，室温避光孵育10min。PBS清洗3次，每次5min；

9.微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（微波建议的温度和时间; 加热到95摄氏度，维持15分钟）此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。

10.重复步骤6，进行第二个一抗的孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将需检测的第二个抗体（一抗）稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的抗体覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5min；

11.重复步骤7，进行对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5min；

12.向组织上滴加50-100μL TSA-555染色工作液确保完全覆盖组织，室温避光孵育10min。PBS清洗3次，每次5min；

13.微波处理：组织切片置于盛满抗原修复液（根据组织类型及抗体选择合适的抗原修复液）的修复盒中进行微波加热处理，去除已经结合的一抗二抗。（微波建议的温度和时间; 加热到95摄氏度，维持15分钟）此步骤中需防止液体过度蒸发导致的干片。

14.重复步骤6，进行第三个一抗的孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将需检测的第三个抗体（一抗）稀释至适当浓度。轻轻甩掉切片上的液体，滴加稀释好的抗体覆盖组织，切片平放于加水的湿盒内4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5min；

15.重复步骤7，进行对应HRP二抗孵育：用PBS（或其他抗体稀释液）将二抗稀释至适当浓度，向组织上滴加二抗，室温孵育50 min。PBS清洗3次，每次5min；

16.向组织上滴加50-100μL TSA-647染色工作液确保完全覆盖组织，室温避光孵育10min。PBS清洗3次，每次5min；

17.细胞核复染DAPI：切片稍甩干后在组织上滴加DAPI（即用型）染色液，避光室温孵育10 min。PBS清洗3次，每次5min；

18.组织自发荧光淬灭（可选）：向组织上滴加组织自发荧光淬灭剂（苏丹黑），室温孵育5min，流水冲洗3min；

19.封片及镜检：切片稍甩干后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并采集图像。切片置于避光切片盒内4℃可保存15天。

1. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。

2. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。

3. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（调整范围1:200 - 1:1000）。

4. 如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育低丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育高丰度目的蛋白对应的抗体。