支原体污染会对细胞各个方面都造成不良影响，已经成为细胞培养中高度重视的问题，因此，定期进行支原体污染检测是十分必要的。本支原体检测试剂盒是采用PCR方法，特异性的检测各种培养细胞生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）中支原体的污染。试剂盒使用的混合引物是针对支原体16s rRNA序列的保守区域设计的特异性引物，可直接使用细胞培养液作为PCR模板，特异性扩增支原体DNA，搭配配套的Mycoplasma PCR Mix（2×）一小时内即可完成，本试剂盒检测灵敏度高，可检测低至20个拷贝的支原体。

储存与运输

      冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，有效期12个月。

操作步骤

      1. 样品准备：取适量待检细胞培养上清于洁净的PCR管中，利用PCR仪95℃热处理5 min后作为模板。血清样本可利用Mycoplasma Free Water稀释后，取适量样本于洁净的PCR管中，利用PCR仪95℃热处理5 min后作为模板；

      2. PCR体系配制：每次实验需设置阴性对照（将1 μL待检样品换成等量的Mycoplasma Free Water）与阳性对照（在1 μL待检样品中加入0.5 μL Positive Control后一起作为Template），实验时戴一次性口罩与手套，谨慎操作，防止操作不当引入外源支原体污染；

      3. PCR程序设置：

      4. 凝胶电泳：取10 μL PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；

      5. 结果分析：每次实验通过与阴性对照、阳性对照检测结果比较确认样品支原体污染情况，阳性条带大小500 bp左右。如阴性对照检测结果中有条带很有可能是PCR体系中出现污染，建议重新实验确认结果。如有必要，也可对PCR产物进行常规测序，以确定具体的支原体种属。

注意事项

      1. 本试剂盒可以检测M.orale，M.arginini，M.bovis，M.fermentans，M.gallisepticum，M.hominis，M.pirum，Ureaplasma spp，M.hyorhinis，M.pneumoniae，A.laidlawii等至少11种以上支原体污染。

      2. 所有试剂在使用前于冰上彻底解冻、混匀，使用完毕后于-20℃保存。

      3. 每次实验必须设置阴性对照、阳性对照，实验组建议设置样品模板梯度。

      4. 操作时必须佩戴口罩，严格按照PCR操作标准，防止引入外源污染影响实验结果。

      5. 为了确保细胞实验的可靠性及稳定性，建议定期进行支原体污染检测。

      6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。