DiO，又称 DiOC₁₈(3)，中文全称3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯并恶唑-2-亚基)-1-丙烯-1-基]苯并恶唑高氯酸盐，分子量881.72，是一类具有亲脂性的长链二烷基碳菁类染料荧光染料，常用于标记细胞膜以及其他脂溶性生物结构。DiO进入细胞膜后可以侧向扩散，逐渐使整个细胞膜被染色。DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞结合后荧光强度会大大增强，被激发后可以发出绿色荧光，并可以用标准的FITC滤光片检测。DiO最大激发波长484nm，最大发射波长501nm。根据DiO的特性，其可以用于活细胞以及固定细胞的染色。此外DiO探针一般不影响细胞的生存能力，故可正向或逆向的标记细胞或某些物质（外泌体）用作示踪检测。

      本产品DiO细胞膜绿色荧光染色试剂盒，包含DiO荧光探针及优化的染色缓冲液，使细胞膜染色更加快速、荧光更加明亮稳定、效果更好。

储存与运输

      干冰(wet ice)运输；-20℃避光保存，探针避免反复冻融，有效期至少6个月。

操作步骤

      1. DiO染色工作液配制：

            1.1. 将DiO细胞膜绿色荧光探针与染色缓冲液以1:250比例混合稀释，配制成DiO染色工作液（现配现用）；注意，DiO探针稀释比可根据具体情况在1:250-1:500进行调整，以获得最佳染色效果。

      2. 悬浮活细胞染色：

            2.1. 收集悬浮细胞，以500-1000 g室温离心3-5 min，去除细胞上清；

            2.2. 使用DiO染色工作液重悬细胞，使细胞密度在1-2×10⁶个/mL；

            2.3. 置于37℃避光孵育5-20 min；建议根据具体细胞调整染色时间，以获得最佳染色效果；

            2.4. 孵育结束后，500-1000 g室温离心3-5 min，吸除DiO染色工作液；

            2.5. 用37℃预热的PBS或细胞培养基重悬细胞，500-1000 g离心3-5 min，去除上清；

            2.6. 重复2.5步骤一次；

            2.7. 流式细胞仪上机检测，或将细胞转移至多孔板、细胞培养皿或者载玻片上，在荧光显微镜下观察。DiO最大激发波长484nm，最大发射波长501nm。

      3. 贴壁活细胞染色（6孔板为例）：

            3.1. 将细胞提前以一定密度种植于6孔板中；

            3.2. 吸除细胞培养基，用PBS（ABC4220）洗涤细胞2次。加入1 mL DiO染色工作液（其他规格孔板，视情况调整，保证染料覆盖细胞）；

            3.3. 置于37℃避光孵育5-20 min，吸除DiO染色工作液。建议根据具体细胞调整染色时间，以获得最佳染色效果；

            3.4. 用37℃预热的PBS或细胞培养基，洗涤细胞1-2次；

            3.5. 加入37℃预热的PBS或细胞培养基，荧光显微镜下观察。DiO最大激发波长484nm，最大发射波长501nm。

      4. 固定的贴壁细胞或切片染色：

            4.1. 样本前处理：

            对于细胞：去除细胞培养基，PBS洗涤1-2次。加入4%多聚甲醛固定液（ABC1119），室温固定 10 min。吸除固定液，用PBS洗涤2-3次。

            4.2. 加入0.1-0.5% Triton-100（PBS配制）处理细胞或切片，室温通透10 min；吸除通透液，用PBS洗涤2-3次；

            4.3. （可选，免疫荧光标记）按照免疫荧光染色的方法进行抗体的孵育或其他染料进行染色。注意。抗体孵育过程中的封闭液、抗体稀释液、洗涤液等不能含有去垢剂。

            4.4. 加入适量体积的DiO染色工作液覆盖细胞，37℃避光孵育5-20 min，吸除DiO染色工作液。建议根据具体细胞样本调整染色时间，以获得最佳染色效果；

            4.5. 细胞或切片经PBS洗涤2-3次，然后置于荧光显微镜观察（细胞需以适量PBS覆盖）。DiO最大激发波长484nm，最大发射波长501nm。

      5. 外泌体荧光标记：

            5.1. 将提取的外泌体沉淀，用适量DiO染色工作液重悬；

            5.2. 将样品置于37℃避光孵育30 min；

            5.3. 用10倍体积PBS稀释样品体积（可选）；

            5.4. 按照之前提取获得外泌体的方案，再一次提外泌体，以去除多余的染料；

            5.5. 收集的外泌体沉淀，用PBS重悬，得到DiO标记的外泌体。可用于相应的后续实验，例如细胞摄取。

注意事项

      1. 荧光染料均存在淬灭问题，请注意避光以减缓荧光猝灭。

      2. 探针亲脂性的特点，实验过程中请避免使用含有甘油或其它有机物的试剂，否则会影响染色效果。

      3. 当需要固定操作时，样品宜在4%多聚甲醛中进行固定，其他不适当的固定液会导致荧光背景高。

      4. 由于细胞间敏感性和实验目的的不同，探针的最佳稀释比和最佳孵育时间需根据实际情况适当调整。

      5. 为了您的健康和安全，操作时请穿好实验服、戴好手套。