绝大多数正常细胞的分裂能力是有限的，在不能分裂后就进入衰老状态，此过程即为细胞衰老（cell senescence），细胞衰老是细胞控制其生长潜能的保障机制，一般含义是复制型衰老（replicative senescence）。正常细胞经过有限次数的分裂后停止分裂，出现不可逆的生长停滞，此时细胞仍然是存活的，但是细胞形态和生理代谢活性发生明显变化，通常表现为细胞体积变大，与衰老相关的β-半乳糖苷酶为活化状态。β-半乳糖苷酶是细胞溶酶体内的水解酶，通常在pH 4.0时表现活性，但在衰老细胞内该酶在pH 6.0条件下表现活性。本试剂盒即是基于此现象及原理，针对衰老相关β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老组织或细胞进行染色。具体反应原理就是以X-Gal为底物，衰老细胞特异性β-半乳糖苷酶催化该底物生成蓝色产物，表现为细胞胞质有蓝色沉积物，可以在光学显微镜下进行观察。按照每个样品染色液用量为1 mL计算，本试剂盒可完成100个样品的染色。

储存与运输

      冰袋（wet ice）运输；4℃避光保存，有效期12个月。其中X-Gal粉末如果配制成溶液后分装成小份-20℃保存，3个月内有效。

使用方法

      l 试剂准备

      1. 自备PBS缓冲液（推荐ABC4220）。

      2. 将100 mg X-Gal粉末用5 mL DMF（二甲基甲酰胺）充分溶解混匀，分装至1.5 mL洁净离心管中，每管0.5 mL，-20℃避光保存。避免反复冻融。

      3. 按照下表比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液。如果是6孔板培养的细胞，每孔需要1.0-1.5 mL染色工作液，如果是12孔板，每孔需要0.5-1.0 mL染色工作液。根据样本量配制染色液，避免浪费。

      l 染色步骤

      1. 对于贴壁细胞

      (1) 6孔板培养好的细胞（或细胞爬片），吸除细胞培养液，用PBS洗涤2次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。

      (2) 弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次2 min。

      (3) 用移液器将PBS 吸除干净，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液，置于37℃孵育2 h至过夜。注意：不能在37℃二氧化碳培养箱中孵育。染色期间需及时观察显色情况，如果样本中β-半乳糖苷酶表达量较高，在数小时内即可完成染色。如果β-半乳糖苷酶表达量低，则需适当延长孵育时间，期间需用保鲜膜或parafilm封住6孔板，防止液体蒸发影响染色结果。

      (4) 普通光学显微镜下观察，阳性细胞显色后，去除染色工作液。如果需要复染细胞核，向孔板内加入少量核固红染液（推荐ABC1053）覆盖细胞室温染色3 min，去除染色液，用PBS清洗数次。

      (5) 加入2 mL PBS覆盖细胞，至此染色完成，此样本可于4℃保存1周。或者加入70%甘油覆盖细胞，4℃可保存较长时间。如果是细胞爬片，则可将爬片充分烤干，二甲苯透明后滴加中性树胶封片，可长期保存。

      2. 对于冰冻切片

      (1) 冰冻切片室温复温10 min。以组化笔画圈，将组织圈出。

      (2) 向组织上滴加适量β-半乳糖苷酶染色固定液，以完全覆盖住组织为宜，室温固定20 min。

      (3) 组织切片经PBS浸泡洗涤3次，每次5 min。

      (4) 将切片置于避光湿盒中，向组织上滴加适量β-半乳糖苷酶染色工作液，需完全覆盖住组织。湿盒放入37℃孵育，每隔2 h显微镜下观察显色情况，如果未见显色，则继续孵育，直到组织上衰老细胞显色。如果样本需过夜孵育，则需滴加足量的β-半乳糖苷酶染色工作液，防止染液蒸发干片。

      (5) 待组织显色后，去除染色液，切片入PBS浸洗2次，纯水浸洗2次。

      (6) （可选）滴加核固红染液（推荐ABC1053）染色3 min，水洗3次。

      (7) 切片无水乙醇脱水2次，每次5 min再经二甲苯透明5 min，滴加中性树胶封片。

      3. 染色结果

      衰老细胞胞质内呈散在分布的蓝色。

注意事项

      1. X-Gal溶液需室温完全解冻混匀后再使用。

      2. β-半乳糖苷酶染色液A和B需提前恢复至室温后再使用，配制好的染色工作液需充分混匀无沉淀方可使用。

      3. 衰老细胞β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件，不能在CO₂培养箱中进行孵育显色，否则会影响染色工作液的pH，导致染色失败。

      4. 配制染色工作液时请选择聚丙烯（PP）或玻璃材质的耗材，不能用聚苯乙烯（PS）材质的耗材。

      5. 在显色2 h-过夜期间需多次观察显色情况，时间过短可能导致阴性结果；时间太长则可能导致假阳性。显色时间与样本本身所含的β-半乳糖苷酶量多少有密切关系。

      6. 在配制染色工作液前，需检查染色液A的pH值，如果不是6.0（可能因保存条件导致pH发生改变），需用HCl或NaOH调节pH至6.0再使用。

      7. 组织切片的β-半乳糖苷酶染色，对于样本的前期准备要求较高，样本需-80℃保存，并尽快完成检测。因为β-半乳糖苷酶非常容易失活，样本保存不当或时间过久，都可能导致酶失活，则染色时没有阳性。

      8. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。

图例：

      Fig.1 WI-38 细胞经β-半乳糖苷酶试剂盒染色，左图为无分裂增殖能力但仍然存活的衰老(senescence)WI-38细胞，经染色后阳性着色细胞大于 95%。右图是新复苏的传代次数小于3次的WI-38细胞(early passage)，经染色后无明显阳性细胞。