行业资讯_单细胞测序，不是只有BD和10×Genomics

单细胞测序，不是只有BD和10×Genomics

信息来源于：互联网发布于：2023-04-20

单细胞测序技术指的是通过高通量测序技术（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一个单个细胞的序列信息，从而更高分辨率地揭示细胞间的细胞差异以及其在微环境中的功能情况。

为什么要做单细胞测序

单细胞测序发展的十余年，使得我们所认知的这个世界越来越精准。我们传统的测序方法，是在组织水平或者说多细胞水平上进行的，最终得到的数据其实是从多个或者多类细胞中得到的平均值，但是无法明确细胞异质性的信息。而单细胞测序，则能够在更精细的单个细胞水平上获得遗传信息，从而揭示每个细胞的基因结构和基因表达状态，反映常规测序所无法得到的异质性信息和稀有细胞的遗传信息。因此也有人称单细胞测序为NGS的“显微镜”。

图1. 单细胞测序发展历程

单细胞测序技术的难点

单细胞测序最大的局限性在于待测核酸的含量，如一个细胞里的DNA或RNA含量仅仅处在皮克 (picograms) 级水平，远远达不到现有建库试剂盒的最低投入量需求。因此，必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其它研究。其次高通量单细胞测序需要增加捕获效率，提高灵敏度。除此之外，样本处理过程中对于稀有样本的获取和难解离组织的细胞分离，也是很大的挑战。

主要的几种单细胞测序技术

◎ 基于微流控液滴的10× Genomics

10×genomics 公司的 Chromium 系统，利用微流控技术将细胞自动分配到 100,000到 1,000,000微反应体系，每个微反应体系含有一种特定的 barcode 序列；含有 barcode 信息的凝胶珠子（GEMs）首先与样品和酶的混合物混合，然后与位于微流体「双十字」连接中的油表面活性剂溶液结合；GEMs 流到储液器中并进行收集。凝胶珠子溶解释放barcode 序列，开始对样本进行标记；最后将每个液滴中含有 barcode 信息的产物混合，然后构建标准测序文库。

10×genomics的优势在于细胞通量高，建库周期短，操作简便，具有超高的捕获效率。不足之处在于只能获得3’端的转录本信息，且样本要求高。

图2. 10×genomics测序原理

◎ 基于微孔板的BD Rhapsody

BD Rhapsody 技术利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸条形码标记微球上实现单细胞捕获和 mRNA 转录本的分子标签，然后将这些微球合并到单个管中用于 cDNA 扩增和文库构建。可满足 100~10,000 个细胞的自动分选、扩增及建库。此外，该技术使用带有寡核苷酸的高质量抗体（Ab-oligos），这条寡核苷酸带有抗体特异的条形码，细胞在经过 Ab-oligos 标记后，可在单细胞水平同时获得转录组和蛋白表达。

相比于10×genomics，BD Rhapsody在捕获效率和有效性上有一定优势。

图3. BD Rhapsody测序原理

◎ 基于PCR扩增的Smart-seq技术

Smart-Seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一项具里程碑意义的技术。细胞被裂解后，将RNA与包含oligo(dT)的引物杂交。然后添加几个无模板的C核苷酸，生成第一条链。这种poly(C)垂悬只添加到全长转录本上。然后将寡核苷酸引物与poly(C)突出杂交，合成第二条链。全长cDNA经过PCR扩增，以获得纳克级的DNA。PCR产物纯化后可用于测序。在后来又有学者对该技术进行改进，新方案使用锁核酸（LNA）、更高浓度的MgCl2以及甜菜碱。它不再需要纯化步骤，可大大提高产量。

Smart-seq相比较于10×genomics检测到的转录本更多，但是不足在于测序reads无法实现链特异性，同时由于对聚腺苷酸化的RNA具有选择性，因此不适用于分析非poly(A)的RNA。

图4. Smart-seq测序原理

◎ 基于线性扩增的MARS-seq技术

通过 T7 启动子连在 oligo dT 引物上，可以在 cDNA 合成后启动 IVT（in vitro transcription ），MARS-seq 2.0 是在 MARS-seq 基础上，整合 index 分选以及大量平行单细胞 RNA测序方法，从而形成的一套流程。

图5. MARS-seq测序原理

单细胞测序技术发展前景

2013年，单细胞测序技术被《Nature Methods》评为年度技术。同年，《Science》将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首。同时随着技术发展更新，单细胞测序技术由早期的高成本、低通量及低自动化发展到目前的低成本、高通量、高自动化，临床应用得到飞速发展，能够快速确定成千上万个细胞的精确基因表达模式，分析每个细胞的遗传异质性。单细胞测序技术发展至今仅10余年，在神经生物学、肿瘤研究、产前基因诊断等多个领域发挥重要作用，早已成为科学研究领域当之无愧的焦点。

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